米兰官网-上海细胞治疗集团与上海大学合作，成功验证通过电穿孔技术从冷冻保存的外周血单个核细胞（PBMCs）来制备高质量CAR

      上海细胞医治集团与上海年夜学互助，乐成验证经由过程电穿孔技能从冷冻生存的外周血单个核细胞（PBMCs）来制备高质量CAR-T的新技能 2025-02-24

近日，上海细胞医治集团与上海年夜学团队互助，配合于Nature旗下的权势巨子期刊Scientific Reports上（IF=3.8），发表了一种经由过程电穿孔技能从冷冻生存的外周血单个核细胞（PBMCs）来制备高质量CAR-T的新技能可行性成果 Comparative analysis and process optimization for manufacturing CAR-T using the PiggyBac system derived from cryopreserved versus fresh PBMCs (DOI:10.1038/s41598-025-89686-7)。研究证明，借助电穿孔技能从冷冻PBMCs制备高质量CAR-T具备可行性。经由过程对于工艺的优化，CAR-T细胞的扩增效率获得显著晋升，抗肿瘤活性也较着加强。该研究为细胞存储与细胞医治结合提供了试验基础，有望为CAR-T医治的普和提供全新的模式，鞭策细胞医治的成长。

CAR-T疗法的疗效于很年夜水平上取决在T细胞的质量，是以，患者免疫细胞的质量与医治的疗效紧密亲密相干。为了包管CAR-T的医治效果，于康健阶段提取PBMC并经由过程冷冻贮存以备后用将是一种有用的要领。然而，冻存的PBMCs是否能维持新鲜状况的特征？冻存PBMC可否实现电穿孔技能制备CAR-T和CAR-T活性是否收到影响今朝还有不清晰；经由过程对于比研究及制备技能的优化对于在鞭策细胞医治范畴的进一步成长很是要害。

文章研究了差别冷冻生存时间：3个月、6个月、12个月及2年对于PBMCs活率的影响，而且及新鲜PBMCs别离制备了mesoCAR-T以确认其功效环境。此中转导采用的是PiggyBac 转座子电穿孔技能，该技能可以冲破病毒制备致使高成本的限定，还有具备可转导较年夜DNA片断的能力等上风。

冻存与新鲜PBMCs细胞活气及表型比力试验事情流程

研究中，经由过程对于比冷冻与新鲜PBMCs发明，冷冻3个月至2年的PBMCs活率依旧可连结不变（约90%）。冷冻后NK细胞及B细胞比例虽然有所降落，但CAR-T重要来历的T细胞比例未显著变化。并且T细胞分解状况，好比初始T细胞Tn、中心影象T细胞Tcm也未因冷冻而发生转变。主要的是三木SEO-，持久冻存也不影响CAR-T的功效：其扩增能力、表型、耗竭标记物都及新鲜来历的PBMCs相似。而且对于SKOV-3细胞（人卵巢癌细胞系）的杀伤效率24小时内可以或许达91-100%，别的细胞因子（如IFN- 、IL-6）排泄程度无较着差异。注解冷冻生存PBMCs活率不变，可以或许解决患者因细胞状况差及制备延迟的问题。

PiggyBac转座子电穿孔制备mesoCAR-T的要害于在工艺，而非冷冻：研究发明虽然mesoCAR-T能乐成地从冷冻2年的PBMC中制备，但于电穿孔后第3天，细胞活率就发生显著降落。该研究经由过程对于CAR-T制备技能的优化，包括降低电穿孔密度及造就密度，终极摸索出一个可以实现更好的mesoCAR-T扩增的最优的工艺【电穿孔密度（1 108cells/mL）及造就密度（1 10⁶cells/mL）】。于这个工艺下，72小时内平均扩增增长67.23%，而不会影响活率。优化后mesoCAR-T对于在肿瘤细胞的杀伤速率较着加速，4小时内便可到达80%肿瘤细胞断根率，且安全性未受影响。

这项研究采用冷冻与新鲜PBMCs对于比发明冷冻3个月至2年的PBMCs活率连结不变，并经由过程优化具备容量较年夜、安全高效等上风的PiggyBac电穿孔CAR-T制备技能使扩增效率晋升，杀伤速率加速，4小时内便可到达80%肿瘤细胞断根率。是以该研究不仅验证了基在电穿孔的要领从冷冻生存的PBMCs中天生高质量的CAR-T的可行性，并且有可能为将来的CAR-T出产成立新的基准，从而提高这些疗法对于更广泛患者群体的可和性及可用性。